转运蛋白及其纳米抗体介绍

2022-10-11

转运蛋白及其纳米抗体介绍

1. 转运蛋白的功能、分类和结构

2. 纳米抗体在转运蛋白结构研究中的应用

3. 纳米抗体及其优势

4. 人工智能驱动纳米抗体的研发

4.1. 利用深度学习预测抗原-抗体相互作用界面

4.2. 计算机辅助抗体人源化改造


1. 转运蛋白的功能、分类和结构

    物质跨膜转运是细胞维持正常生命活动的基础之一,通过跨膜运输,可以沟通细胞内外及细胞内各细胞器之间的联系,保证新陈代谢等生命活动中的正常物质交换和信息传递。转运蛋白(Transporters)是负责物质跨膜转运最重要的膜蛋白,广泛存在于细菌、真菌、植物、动物和人体等各类生命体组织中,在物质代谢、能量交换、信号传导等生理过程均发挥着极为重要的作用。例如, 生长素转运蛋白(Pin-formed1, PIN1)调控着植物生长素的极性运输,葡萄糖转运蛋白家族(Glucose Transporters, GLUTs)控制着细胞对葡萄糖的摄入和能量代谢。


1.1. 物质跨膜转运基本类型:自由扩散、易化扩散和主动转运。

   物质跨膜转运的方式一般分为:被动运输和主动运输,与之对应的转运蛋白分别为易化扩散蛋白(Facilitator)和主动转运蛋白(Active Transporter)。易化扩散蛋白协助亲水性营养物质(葡萄糖、氨基酸、Na+、K+、Ca2+等)顺浓度梯度跨膜转运。主动转运蛋白又分为一级主动转运蛋白(Primary Active Transporter)和二级主动转运蛋白(Secondary Active Transporter),前者依赖ATP水解为转运过程提供能量,后者利用膜内外离子浓度差,通过协同转运离子为转运过程提供能量。二级转运蛋白根据底物和离子协同转运方向的差异可以分为单向转运体(Uniporter)、同向转运体(Symporter)和逆向转运体(Antiporter)。在结构上,一级转运蛋白有胞外ATP结合位点,因此又被称为ATP结合转运蛋白(ATP Binding Cassette Transporters)。二级转运蛋白往往含有12-14次跨膜螺旋组成的两个亚基结构域:CTD(C-terminal bundle)和NTD (N-terminal bundle),转运过程中通过两个结构域相对位置的变化将底物跨膜转运。


1.2.二级主动转运蛋白的分类及蛋白结构举例。

2. 纳米抗体在转运蛋白结构研究中的应用

   由于转运蛋白在生理功能上的重要性,其高分辨三维结构的解析一直是研究的热点。纳米抗体是具有紧凑的单个免疫球蛋白结构域结构,能够以较高亲和力结合目标转运蛋白,同时减少其构象异质性并稳定多蛋白复合物,在辅助转运蛋白结构研究中展现了优势。
    叶酸(也称为维生素 B9)作为合成核酸、氨基酸和通用甲基化试剂S-腺苷酸甲硫氨酸的起点,在细胞代谢中起着至关重要的作用。叶酸缺乏与许多发育、免疫和神经系统疾病有关。质子偶联的叶酸转运蛋白(PCFT,也称为SLC46A1)介导通过肠道刷状缘膜和脉络膜丛的叶酸摄取,并且是在癌症化疗中递送抗叶酸药物的重要途径然而PCFT如何识别叶酸或抗叶酸剂机制一直有待研究。英国牛津大学Simon Newstead等研究人员通过开发PCFT特异性纳米抗体,成功解析了PCFT与纳米抗体复合物高分辨率结构,揭示了PCFT识别和转运叶酸拮抗剂的结构基础。2021526日,国际知名学术期刊《Nature》在线发表了这一成果。
    葡萄糖的吸收为人体提供了基本的能量来源,营养物质经过消化后,在肠道中进行吸收。科学家发现钠-葡萄糖共转运蛋白1SGLT1)介导了这个主动转运过程。半个多世纪来,SGLT1的生理功能和转运机制得到了大量研究。科学家发现,SGLT1除了在肠道中吸收糖,还与同一个家族的SGLT2一起,在肾脏中葡萄糖的重吸收方面扮演着重要角色,成为治疗糖尿病的重要药物靶标。因此,理解钠-葡萄糖转运的蛋白结构及作用机理,在生理及医疗方面都有重要意义。然而,揭示SGLT1的冷冻电镜结构极具挑战性,SGLT1结构研究的主要难点在于两个方面:SGLT1蛋白整体比较小,不利于冷冻电镜的研究;此外,蛋白在去垢剂中不稳定,难于纯化。斯坦福大学冯亮教授团队与Georgios Skiniotis教授团队合作筛选出对SGLT1高亲和力的纳米抗体,显著增加了蛋白膜外区的特征,成功获得了分辨率为3.15 ÅSGLT1冷冻电镜结构,并揭示了SGLT1作为转运蛋白的结构机理。2021129日,国际知名学术期刊《Nature》在线发表了这一成果。
    生长素几乎参与了植物生长发育调控的每一个过程,例如胚胎发育、根发育、叶发育、花发育、向光性和向重力性等。在生长素极性运输过程中,位于膜上的转运蛋白发挥了关键作用,其中生长素外排蛋白家族PINPin-formed auxin exporter)尤为重要。由于缺乏精细的三维结构,PIN家族蛋白特异性识别、转运生长素的机制未知,这是生长素研究领域亟待解决的关键科学问题。为了解决蛋白构象不稳定及分子量较小的问题,中国科学技术大学孙林峰团队与中科院分子细胞科学卓越创新中心李典范团队合作,利用体外纳米抗体合成技术,得到大量靶向PIN1蛋白的纳米抗体,进一步通过亲和力、热稳定性分析缩小了抗体筛查范围。最终,研究利用冷冻电镜单颗粒重构技术,解析了PIN1与一种纳米抗体结合的、分辨率为3.0埃的结构,首次揭示了经典PIN家族蛋白成员的样貌。202282日,国际知名学术期刊《Nature》在线发表了这一成果。
    胱氨酸贮积症(cystinosis)是第一个被记载的由于溶酶体转运功能异常所导致的遗传疾病。溶酶体胱氨酸是细胞内半胱氨酸的主要来源。胱氨酸贮积症的发生是编码溶酶体胱氨酸转运蛋白cystinosin的基因突变所致。Cystinosin的功能缺失会引发胱氨酸在溶酶体内异常积累,进而导致全身多器官的功能障碍。因此,cystinosin结构和功能的研究对揭示溶酶体氨基酸的转运机制,以及理解胱氨酸贮积症发生的分子基础具有重要意义。斯坦福大学冯和加州大学圣克鲁斯分校的Glenn Millhauser等研究人员成功开发了与cystinosin具有高亲和力的纳米抗体P10,并在纳米抗体的辅助下利用晶体学和冷冻电镜两种技术手段解析了人源cystinosin的结构,为理解该蛋白家族外排溶酶体氨基酸的工作机制奠定了基础。2022915日,国际知名学术期刊《Cell》在线发表了这一成果。

2.1. 纳米抗体(红色)辅助叶酸转运蛋白(PCFT)、葡萄糖转运蛋白(SGLT1)生长素转运蛋白(PIN1)和胱氨酸转运蛋白(Cystionosin)解析的高分辨率结构。


3.纳米抗体及其优势

    抗体是一种免疫球蛋白,大多数动物和人类体内的IgG抗体为由轻链和重链组成的Y形结构,分子质量一般在150 kD左右。纳米抗体是科学家1989年发现的一种来源于骆驼科动物体内、天然缺失轻链的重链抗体可变区,分子质量只有15 kD,是常规抗体分子质量的1/10。其蛋白质晶体结构长度为4 nm,直径为2.5 nm,是目前已知分子质量最小的抗体,因此称之为纳米抗体


3.1. 传统抗体和纳米抗体结构对比。(A)传统抗体及其片段示意图,蓝色代表重链,红色代表轻链;(B)羊驼纳米抗体及其VHH片段;(C)纳米抗体晶体结构(PDB编码:6OS1);(D)纳米抗体VHH二维拓扑结构图,蓝色代表CDR1,黄色代表CDR2,红色代表CDR3


    相较于传统抗体,纳米抗体在活性、稳定性、水溶性和穿透力等方面具有明显的优势。1纳米抗体相对分子质量小而抗原结合活性强纳米抗体结构及活性部位如图2.1所示,其只有3个高度可变区域(CDR1/CDR2/CDR3)。由于纳米抗体的CDR3长度比一般抗体的CDR3长,在一定的程度上弥补了因轻链缺失而造成的结合力下降,从而使其具有较强的抗原结合能力。并且,纳米抗体不含有多余冗杂结构,仅保留了最关键的抗原结合活性部位,这些部位被保守的框架区域(非高度可变区域FR1/FR2/FR3/FR4)所包围,形成了形状较小的凸状、凹槽状或口袋状等空腔,可以优先识别裂口,并结合这些隐藏和凹陷的抗原表位,这也是常规抗体难以识别的表位,因此,具备上述抗原结合活性是纳米抗体相较于常规抗体特有的一大优势,这也是它分子质量小但抗原结合活性强、不亚于常规抗体的原因。2) 纳米抗体稳定性高。常规传统抗体稳定性较差,然而纳米抗体的稳定性却非同一般,主要归因于其内部存在额外的二硫键。在常规抗体中,形成环间二硫键的现象极少,而在纳米抗体中却较为普遍。基于二硫键不易断裂,构象不易发生改变,所以纳米抗体往往相对常规抗体更耐高温和高浓度的有机溶剂。3纳米抗体水溶性更好。相对于传统抗体,纳米抗体FR2区的4个脂肪族氨基酸残基被亲水性氨基酸取代,使得亲水性大幅提高,且部分FR2被拉伸扭转的CDR3环覆盖,避免与外界水环境的接触,从而防止纳米抗体的二聚化。因此,相比于常规抗体,纳米抗体的水溶解性更好,表达量通常也较高。4纳米抗体穿透力强。纳米抗体分子质量小、体积小,可瞬间穿透细胞进入胞内,高效捕获相关病原。这也是体积较大穿透力不够强的常规抗体所难以实现的。

4. 人工智能驱动纳米抗体的研发

    纳米抗体的研发能够创造巨大的经济效益和社会效益,然而研发过程中需要根据用途不断对抗体进行改造和优化,往往耗费大量的时间和成本。近年来,随着生物信息学和人工智能技术(Artificial Intelligence, AI)的发展,依靠计算机辅助技术和AI赋能的纳米抗体合理设计正展现出前所未有的优势。

4.1. 利用深度学习预测抗原-抗体相互作用界面

   抗原-抗体相互作用界面模拟、分析和优化是进行抗体设计关键的步骤之一。以图形表示蛋白界面的图形神经网络(GNN)也已被应用于蛋白界面的预测。深度神经网络在结构生物学中的应用有一个著名的案例,即AlphaFold2成功预测了超过95%人类已知蛋白库的三维空间结构。然而,预测抗原-抗体蛋白复合物的3D结构仍然是一大挑战,主要原因在于:首先,蛋白界面受物理化学规则的控制,不同类型的蛋白复合物(如酶-底物与抗体-抗原)可能具有不同的显性相互作用特征;其次,蛋白质相互作用可以在不同的水平上进行表征:原子-原子水平、残基-残基水平和二级结构水平;第三,蛋白质界面,在形状、大小和表面曲率方面具有高度多样性;最后,蛋白质的大量原子坐标文件的高效处理和特征化,在计算成本和文件存储需求方面是令人生畏的。

       荷兰乌德勒支大学的Alexandre M. J. J. Bonvin Li C. Xue等研究者开发了DeepRank,一种基于3D CNNs的蛋白质-蛋白质界面数据挖掘的通用深度学习平台。DeepRankPDB中生物分子复合物的三维原子坐标计算出的原子和残留级特征映射到三维网格上。DeepRank允许使用包含数百万PPIs的数据集,高效地训练3D CNNs,并支持分类和回归。研究者展示了DeepRank在两个不同挑战上的表现:生物与晶体学PPIs的分类,以及对接模型的排序。其框架由两个主要部分组成,一个是数据预处理和特征化,另一个是神经网络的训练、评估和测试,

4.1 . 基于深度学习神经网络GNN 预测蛋白-蛋白相互作用界面模 DeepRank工作框架。



     DeepRank展现出如下优势特征:1) 特性计算。从描述蛋白-蛋白复合物的3D结构的PDB文件开始,DeepRank利用pdb2sql来识别两个链之间的界面残基;默认情况下,界面残基定义为那些与任何原子在5.5 Å距离截止(可配置)的其他链的任何原子。但是用户可以轻松定义新的特性,并将这些新的特性包含在他们的特性计算工作流中2) 三维网格特征映射DeepRank利用高斯映射,将复合体界面的原子和残基特征映射到三维网格上。由于这种高斯映射,每个特征在三维特征网格上都具有非局部效应,从而形成大量的网格点。PPIs的这种特征映射产生了一个3D图像,其中每个网格点包含多个通道值,对应于界面的不同属性。多种数据增强和PPIs结构对齐策略可以丰富数据集3) 灵活的靶标值定义和计算。用户可以很容易地为自己的蛋白结构定义特定问题的靶标值。在计算对接场景下,评估对接模型质量的标准指标是通过与参考结构的比较得到的,CAPRI(预测交互的关键评估)中使用的一些指标已集成到DeepRank中。比如配体RMSD、界面RMSD (iRMSD)FNAT(原生接触分数)CAPRI质量标签和DockQ评分。DeepRank能利用pdb2sql高效地执行这些计算4高效的HDF5格式数据存储。处理数千万个具有丰富特征表示的PDB文件,对文件系统和深度神经网络的有效训练都是一个挑战。DeepRankHDF5格式存储特征网格,特别适合存储非常大的异构数据集。

4.2. 计算机辅助抗体人源化改造

    通过免疫小鼠或者羊驼获得高亲和力和生理活性的杂交瘤单抗,再通过抗体可变区基因克隆获得其蛋白序列,进而通过抗体的人源化改造获得人源化抗体,仍然是目前治疗性抗体发现的常规策略。由于抗体人源化的改造涉及抗体氨基酸序列甚至结构的变化,使用计算机辅助药物设计技术进行基于结构的抗体人源化设计,可以在人源化过程中既保持或基本保持其嵌合抗体形式对抗原的亲和力,特异性,生理学活性,又同时不影响其药物可开发性(通常表现为表达水平,理化性质,稳定性等)。CDR区域主要参与抗体与抗原的相互作用,那最常规的人源化思路就是把这些决定抗原-抗体相互作用的CDR区域移植人的Framework区域中去,从而降低鼠抗在人体中产生的免疫原性。CDR移植的方法最早由2018年诺贝尔化学奖得主Greg Winter团队在20世纪80年代后期提出,经过几十年的发展,该技术目前已经相对成熟,也是目前业界使用最为广泛,最为认可的人源化策略。基于CDR移植的人源化策略主要分为以下几个步骤:1) 选定移植区域;2) 选定合适的Framework供体(有时候也叫做Framework受体);3) 对影响抗体结构和功能的关键氨基酸进行回复突变。下文将从这三个方面对该策略进行展开论述。

1选定移植区域

   抗体人源化项目开展之前最理想的方式是得到抗体-抗原复合物的晶体结构,这有助于理性地分析哪些区域参与了抗原-抗体的相互作用,从而选定这些区域作为CDR移植的供体。但遗憾的是,大绝大多数情况下,这种结构信息通常是不存在的。对于这种情况,通常采用全部六个CDR区作为移植的供体。如前所述,由于CDR是最早是基于序列的定义,其在结构上与参与抗原-抗体相互作用的loop区有重叠但并非完全一致,而不同方法定义的CDR区域也有所不同,此时可以结合结构信息,综合选定所要移植的区域。对于一个已知序列未知结构的抗体,目前有很多商业化软件(MOE, Schrodinger/Bioluminate)可以提供抗体结构的同源建模分析。如果项目对人源化程度/免疫原性比较在意,希望尽量少地移植鼠抗序列,那可以考虑只进行SDR而非CDR的移植。或者通过突变体结合实验,证明某些CDR可能并不参与抗原抗体的相互作用,从而只移植部分CDR区域,这些方法都成功的案例报道。

4.2. CDR移植策略设计人源化抗体示意图。



2选定Framework供体

       CDR移植技术的发展过程中,人们对于供体Framework的选定有不同的方法。人们最早采用直接把鼠源CDR移植到一些已知结构的人源抗体中,其中并不考虑鼠源抗体与人源抗体在序列上的同源性。但是这种方法得到的移植后抗体往往亲和力较鼠抗或嵌合抗体有明显的下降。这使人们认识到不同人源抗体Framework对被移植的CDR结构的支持作用是不一样的。进而人们考虑选择与鼠抗同源性较高的人抗体Framework序列作为移植供体,这种方法被称为Best Fit策略。如前所述,除了比较序列一级结构的同源性,可以在选定供体Framework的时候就考虑其与被移植抗体在Canonical结构上的一致性,这往往有助于CDR loop结构的维持与抗原-抗体亲和力的保持。也有人在供体Framework序列中不考虑Framework的同源性,而是考虑CDR区域的同源性,这也是基于选定的Framework序列能够较好地支持CDR结构的考虑。关于Framework序列的来源有两种,一种是发表的人源或人源化抗体序列,这些序列可以通过PDB, IMGT等数据库获得,但是这些人源序列往往已经经历体细胞高频突变过程,其Framework区已经积累一些突变,这些突变对于候选抗体可能是无益且存在免疫原性风险的。第二种来源是未成熟的人胚系基因(germline gene),这些基因未经体细胞高频突变,理论上产生免疫原性的可能性更低。另外,也有研究表明,相对于体细胞成熟的抗体,germline序列作为Framework能够给CDR区域提供更好的柔性,使得被移植的CDR结构能够更好地保持。目前人们更多地使用germline gene framework而非成熟抗体framework作为移植的Framework供体。

3确定回复突变位点

     CDR移植后的抗体通常其亲和力会发生降低,这可能是由于前述的一些支撑CDR结构的关键位点在人源化的过程中发生了改变。为了恢复抗体的结合和生理活性,往往需要对CDR移植后的抗体进行关键氨基酸的回复突变,保留其鼠源序列。在此过程中,往往需要考虑亲和力/功能/可开发性等与免疫原性/人源化程度的平衡。对于不同的项目,其所需要的回复突变数量不尽相同,而其中的突变位点的选择也十分关键。如前所述,抗体中存在的Canonical StructureVernier Zone等区域的氨基酸可能对于维持CDR loop结构非常重要,如果在人源化过程中,这些残基发生了突变,可能对其结构和活性的维持具有重要影响,因此这些关键的氨基酸位点通常是给予首先考虑进行回复突变的。另外,Framework内部与CDR区域在空间上比较近的区域,比如通常认为5A3A以内的Framework氨基酸,可能对与CDR区域存在分子内相互作用,或者直接参与了与抗原的相互作用,这些氨基酸如果在人源化过程中被突变,也可以纳入回复突变的候选位点。通过抗体已知或建模结构的分析,综合不同级别优先性的重轻链回复突变,再对这些不同回复突变的突变体进行重轻链的棋盘式组合,可以筛选到回复突变较少,而亲和力/生理功能/可开发性符合项目预期的药物候选分子。


 4.3. 回复突变位点选择三种类型:1)位于VLVH结合界面上的残基,对于两个结构域的Packing起到关键作用;2)靠近CDR区并且包埋于蛋白内部的残基;3)与CDR区有直接相互作用的残基,相互作用包括:疏水相互作用/氢键/盐桥。



关于康体生命:

       康体生命是一家单域纳米抗体研发生产销售和靶向GPCR等重要膜蛋白药物靶点技术服务于一体化的国家高新技术公司。公司由国家级特聘专家领衔,技术团队由多位生物医药博士负责,组建有哺乳动物细胞、昆虫、酵母、大肠杆菌等蛋白表达纯化平台,纳米抗体发现平台,抗体工程平台,质量分析平台等,为客户提供纳米抗体定制研发解决方案。实验室拥有面积2000平米及千万的仪器设备。主营业务:为国内外(上市医药企业) (诊断企业) (高校科研机构)提供抗体药物CRO业务。技术核心拥有覆盖鲨鱼、骆驼、羊驼等物种的驼类纳米抗体药物筛选平台,提供从抗原、免疫、建库、筛选、表达纯化、功能验证、发酵罐生产,各阶段的纳米抗体药物定制服务。 

GPCR膜蛋白纳米抗体开发博士团队免疫或筛选过的抗原靶点包括但不限于 HPV16, HPV18, Claudin18.2, Lilrb-2, Amyloid A, Procalcitonin, TAC2, PD-1, PD-L1, CTLA4, CD3(epsilon & gamma), Integrin, 病毒样颗粒,AAV,IL-5, PCSK9, KLH 偶联的各种多肽包括磷酸化多肽及乙酰化或甲基化多 肽,KLH-HA,KLH-Myc,KLH-Flag,GST,CD7, CD28,CD33, CD38,CD70,CD73, CD79, CD22,CD123, CD167,GRP78,Human RAGE, HSP70,HSP90,ROR1,IGF2R,IGFBP5,GPC3,SARS-CoV-2 S1 包 括 Delta 及 Omicron RBD 蛋白,EBV gHgL,KRAS,CXCL1,GUCY2C,hTPX2,Nectin4,Leptin,FGF R4, VEGFR2,VEGFR3,FAP,CEACAM5,PSMA,PSA,YAP,B7H7, TIGIT, VEGF A, IL-2R, Wnt2,人载脂蛋 白 A-1,人载脂蛋白 B,人血红蛋白, SERPINA3,人转铁蛋白, GFP, mCherry,鼠 IgG, 兔 IgG 及许 多客户提供的不知名的靶点蛋白。除了蛋白抗原外,康体生命科技有限公司也用细胞、灭活病毒,mRNA等对羊驼进行免疫。康体生命的客户除了国内一线医药公司,临床诊断企业及各高校实验室外,国际客户覆盖德国,比利时,美国,澳大利亚,泰国,韩国等。


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