噬菌体文库构建

1.     实验目的

使用抗原免疫后羊驼PBMC构建噬菌体文库

2.     实验设计

从羊驼PBMC中提取总RNA,反转录为cDNA,经过两轮PCR扩增后得到抗体序列扩增产物,选择载体进行酶切后连接,最后转化至SS320大肠杆菌感受态细胞得到细菌文库,经过辅助噬箘体(M13KO7)侵染并诱导后制备获得噬菌体文库。

3.     实验方法与步骤

3.1RNA提取

3.1.1将羊驼PBMC样品从-80℃冰箱中取出,分装0.5ml/管,每管中加入100μl氯仿,在震荡器上剧烈震荡15s后,室温放置静置5min

3.1.2将离心机预冷至4℃12000g离心15min,离心后出现分层,将最上层的透明层用移液枪小心转移到新的无RNaseDNase1.5ml离心管中,每管加入250μl的异丙醇,上下颠倒多次混匀后室温放置静置10min

3.1.3 12000g离心10min去除上清保留沉淀

3.1.4每管加入1ml 75%乙醇,上下颠倒多次以悬浮沉淀;

3.1.57500g离心5min,去除上清保留沉淀;

3.1.6保持离心管口打开,室温放置干燥10min,每管加入DEPC处理水溶解,55℃孵育10min以确保RNA完全溶解;

3.1.7小心吸取至同一个离心管中,即为PBMC中提取出的总RNA

3.1.81μl上述总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳以检测总RNA的完整性,同时取2μl用核酸浓度测量仪检测RNA的浓度和A260/A280并记录。

3.2  RNA反转录

样品在总RNA提取后立即使用反转录试剂盒进行反转录以减少RNA的降解。

3.2.1将上述总RNA样品分为两份,一份使用试剂盒内的Oligo dT Primer作为引物,另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物,在1.5ml离心管中按下表比例配置反应液,当总RNA量大于5μg时,同比例扩大反应体系

试剂

使用量

Oligo dT Primer50μM)或者

Random 6-mers50μM

1μl

dNTP Mix

1μl

RNA

5μg

ddH2O

Up to 10μl

3.2.2将含有上述反应液的离心管放入金属加热器中,65℃反应5min使RNA变性,反应结束后置于冰上迅速冷却;

3.2.3在上述1.5ml离心管中按下表比例配置反应液,当管内总体积大于10μl时,同比例扩大反应体系

试剂

使用量

反应液

10μl

5×PrimeScript II Buffer

4μl

RNase Inhibitor

0.5μl

PrimeScript II RTase

 1μl

ddH2O

Up to 20μl

3.2.4缓慢混匀后,将含有上述反应液的离心管放入金属加热器中,45℃反应60min75℃反应15min,冰上冷却,即为总RNA反转录后的cDNA-20℃保存。

3.3 PCR扩增

3.3.1第一轮PCR

6.3.1.1 cDNA为模板进行第一轮PCR反应,为了确定最佳模板使用量,分别使用0.5μl1μl2μl3μl4μl5μloligo dT Primerrandom 6-mercDNA作为模板,按照下表配置PCR反应体系:

试剂

使用量

cDNA

0.5-5μl

AlpVh-L/CALL 002

2μl/2μl

dNTP Mix

4μl

10×ExTaq Buffer

 5μl

HS Ex Taq

0.25μl

ddH2O

Up to 50μl

按照下表配置并进行PCR反应:

循环

    温度

时间

步骤1

98℃

3min

步骤2

94℃

50s

55℃

30s

72℃

40s+2s/cycle

  转到步骤2

23 cycles

步骤3

72℃

5min

步骤4

4℃

forever

3.3.1.2反应结束后,取20μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量,将所有cDNA按照此模板量并使用3.3.1.1相同条件进行PCR反应;

3.3.1.3将所有PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,并切胶回收目的片段大小在600bp左右的条带;

3.3.1.4使用通用型DNA纯化回收试剂盒对切胶的胶条进行DNA回收,根据试剂盒说明书,按照下述步骤进行:

1)柱平衡:向放入收集管中的吸附柱CB2中加入500μl平衡液BL12000 rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;

2)将从琼脂糖凝胶中切下的DNA条带放入干净的离心管中,称取重量;

3)向胶块中加入等体积PC溶液(如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100μl,则加入100μlPC溶液),50℃水浴放置10 min左右,其间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解;

4)将上一步所得溶液加入平衡过的放入收集管中的吸附柱CB2中,12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB2放入收集管中;

5)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB2放入收集管中;

6)重复操作步骤 5);

7)将吸附柱CB2放入收集管中,12000rpm离心2min,尽量除去漂洗液,将吸附柱置于室温放置2min,彻底晾干;

8)将吸附柱CB2放入一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加30μlddH2O,室温放置2min12000 rpm 离心2 min,收集DNA溶液;

(9)       将所有纯化回收产物收集至一个离心管中,即为第一轮PCR扩增产物,-20℃保存。

3.3.2 第二轮PCR

3.3.2.1将第一轮PCR扩增产物作为模板进行第二轮PCR反应,为了确定最佳模板使用量,分别使用0.1μl0.2μl0.3μl0.5μl1.0μl2.0μl作为模板,按照下表配置PCR反应体系:

试剂

使用量

第一轮PCR回收产物

0.1-2μl

Rvhh FP/RvhhRP

2μl/2μl

dNTP Mix

4μl

10×ExTaq Buffer

 5μl

HS Ex Taq

0.25μl

ddH2O

Up to 50μl

按照下表配置并进行PCR反应:

循环

温度

时间

步骤1

98℃

3min

步骤2

94℃

50s

55℃

30s

72℃

40s

转到步骤2

11cycles

步骤3

72℃

5min

步骤4

4℃

forever

3.3.2.2反应结束后,取20μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量,将已获得的第一轮PCR扩增产物的1/20体积共576个反应按照此模板量并使用3.3.2.1相同条件进行PCR反应;

3.3.2.3使用通用型DNA纯化回收试剂盒对PCR反应液进行DNA纯化,根据试剂盒说明书,按照下述步骤进行:

1)柱平衡:向放入收集管中的吸附柱CB2中加入500μl的平衡液BL12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;

2)根据PCR 反应液的体积,向其中加入等倍体积PC溶液,充分混匀;

3)将上一步所得溶液加入一个放入收集管中的吸附柱CB2中,室温放置2min12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中;

4)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先确认已加入无水乙醇),12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB2放入收集管中;

5重复操作步骤(4

6)将吸附柱CB2放入收集管中,12000rpm离心2min,尽量除去漂洗液,将吸附柱置于室温放置2min,彻底晾干;

7将吸附柱CB2放入一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加30μlddH2O,室温放置2min12000 rpm 离心2 min,收集DNA溶液。

8)将回收回的所有产到物收集至一个离心管中,即为第二轮PCR扩增产物,同时取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录,其余产物-20℃保存。

3.4 载体与PCR产物酶切连接

3.4.1酶切体系分别如下表。

载体酶切体系:

试剂

用量

载体

10μg

Bgl 1

10μl

3.1 10×Buffer

50μl

ddH2O

Up to 500μl

第二轮PCR扩增产物酶切体系:

试剂

用量

第二轮PCR扩增产物

4μg

Bgl 1

4μl

3.1 10×Buffer

20μl

ddH2O

Up to 200μl

3.4.2 37℃孵育2h,分别补加10μl2μl限制性内切酶Bgl 1至载体和PCR扩增产物反应中,继续酶切2h

3.4.3酶切结束后,使用通用型DNA纯化回收试剂盒纯化载体和酶切产物,纯化步骤同3.3.2.3

3.4.4酶切反应纯化后,分别取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度,然后按照下表配制连接反应体系

试剂

用量

PCR产物

1.6μg

载体

4μg

T4连接酶

30μl

10×T4 reaction Buffer

200μl

ddH2O

Up to 2000μl

3.4.5将上述连接反应4℃过夜(约16h)孵育;

3.4.6酶切结束后,使用通用型DNA纯化回收试剂盒纯化连接反应液,纯化步骤同3.3.2.32μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录,4保存。

3.5细菌文库构建

将连接产物进行电击转化后构建含有纳米抗体片段的大肠杆菌文库。

3.5.1100ng回收连接产物,按照以下步骤进行电击转化:

3.5.1.1-80℃超低温保存箱取出1SS320大肠杆菌感受态细胞,冰上放置5min使其融化;

3.5.1.2使用提前预冷的枪头加入100ng连接产物,轻轻吹匀,转移到已经预冷的1mm电转杯中,轻敲电转杯,让混合物流至电转杯底部;

3.5.1.3设定1800V1mm间距,进行电转,完成后立即加入950μl 37℃预温的SOC培养基,将菌液从电转杯中快速取出至1.5ml离心管中,37℃200rpm震荡复苏1h

3.5.2复苏后的菌液按使用2×YT液体培养基进行10倍梯度稀释,共稀释6个梯度,即将复苏后的菌液取100μl稀释到1000μl,再从中取100μl稀释到1000μl,依次类推,共稀释101001000100001000001000000倍;

3.5.310倍梯度稀释中每管取100μl均匀涂布到2×YT固体培养基(Amp),37℃静置培养过夜;

3.5.4数出梯度稀释平板上的菌落数目,并使用公式计算连接效率:

3.5.5同时随机挑选平板上的48个单克隆菌,接种于含有氨苄抗性的1ml 2×YT液体培养基(Amp)的离心管中,37℃培养3h,按照下表配制PCR反应并进行单菌落PCR

PCR反应体系:

试剂

使用量

菌液

2μl

FP/RP

2μl/2μl

dNTP Mix

4μl

10×Taq Buffer

 5μl

Taq

0.25μl

ddH2O

Up to 50μl

PCR反应条件:

循环

温度

时间

步骤1

98℃

3min

步骤2

94℃

30s

58℃

30s

72℃

30s

转到步骤2

25cycles

步骤3

72℃

3min

4℃

forever

3.5.6将单菌落PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,目的条带片段大小为600bp的菌落认定为阳性克隆,按公式计算连接产物阳性克隆率:

3.5.7按照3.5.1相同方法进行20个电击转化反应,将复苏后的全部菌液集中至一个15ml摇菌管中混匀,取100μl复苏菌液按照3.5.2-3.5.6方法计算连接效率和阳性克隆率,其余复苏菌液则均匀涂布到5个含有100μg/ml Amp2%葡萄糖的2%琼脂糖的245mm方形培养基平板中,37℃正置过夜培养;

3.5.8取过夜培养的方形板,在每个培养板表面加6ml 2×YT液体培养基,用涂布棒轻轻将5个方形板菌落刮下并将菌液收集至同一个50ml离心管中,加入终浓度为20%的甘油,即为细菌文库。阳性克隆率为按照3.5.6方法计算出的阳性克隆率,库容量按照公式计算;

3.5.920μl上述细菌液到980μl 2×YT液体培养基中并使用分光光度计测量OD600,根据以下公式计算记录细菌文库总OD600;将细菌文库菌液进行分装10管,1ml/管,其余保留在50ml离心管中,-80℃保存

3.5.10从菌落PCR检测的阳性克隆中随机挑选48个克隆送测序,将测序结果中纳米抗体片段翻译成氨基酸序列后进行序列比对,检测细菌文库中序列多样性。

3.6 噬箘体文库构建

3.6.1噬菌体扩增

3.6.1.1-80℃冰箱中取出细菌文库,冰上融化,根据下面公式计算出相应菌液量,转接到100ml10μg/ml Tet100μg/ml Amp2×YT液体培养基中,以使初始OD6000.1

3.6.1.2在恒温摇床中37℃250rpm 培养直至菌液OD600达到0.5-0.55

3.6.1.3加入辅助噬菌体M13KO7以使细菌个数:噬菌体数=120

3.6.1.4在恒温摇床中37℃220rpm继续培养30 min

3.6.1.5分别加入终浓度为50μg/ml Kana和终浓度为0.2μM IPTG,恒温摇床中30℃250rpm过夜培养。

3.6.2噬菌体文库制备

3.6.2.1将过夜培养的菌液转移至新的50ml离心管中4000 rpm4 ℃离心10min

3.6.2.2将离心后的上清液转移至新的50ml离心管中,加入1/4体积的4℃预冷的20PEG/2.5M NaCl,充分混匀后冰上放置30min

3.6.2.3 4000 rpm4 ℃离心20 min,弃上清,并在纸上倒置2min

3.6.2.4加入1ml PBS重悬沉淀,将重悬液移至新的1.5ml离心管,12000rpm4 ℃离心20min

3.6.2.5将离心后的上清转移至新的1.5ml离心管,加入1/4体积预冷的20PEG/2.5M NaCl溶液,混匀后冰上放置10min

3.6.2.6 12000rpm4 ℃离心10min,弃上清,加入1ml PBS重悬沉淀;

3.6.2.7 12000rpm4 ℃离心2min,将上清转移到新的1.5ml离心管中,即为噬菌体文库,100μl /管分装,长期-80℃保存,短期(1-2周)可于4℃放置保存。

3.6.3噬菌体文库效价检测

3.6.3.1-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基(Tet抗性)进行单菌落划线,37℃过夜培养(4℃保存一周),从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml含有10μg/ml Tet2×YT培养基,37℃过夜培养;

3.6.3.2取过夜培养菌液250μl转接到含5ml含有10μg/ml Tet2×YT液体培养基中,37℃,250rpm培养约45min-60min后至OD6000.5-0.55

3.6.3.33.7.2方法制备好的噬菌体文库10μl,在1.5ml离心管中10倍梯度稀释,共稀释12个梯度,即将噬菌体文库取10μl稀释至100μl,再从中取10μl稀释至100μl,依次类推,共稀释12梯度至10-12,振荡混匀;

3.6.3.4在每个稀释离心管中加入90μlSS320菌液,混匀后37℃孵育30min

3.6.3.5从每个稀释离心管中取5μl滴加到2×YT固体培养基(Amp)中37℃过夜培养;

3.6.3.6统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量,并按照下面公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量,即噬菌体文库效价。

4.     实验结果

4.1 RNA提取和反转录

4.1.1 RNA琼脂凝胶电泳结果:

1 羊驼PBMCRNA琼脂糖凝胶电泳结果

4.1.2反转录cDNA结果:

4.2 PCR扩增

4.2.1第一轮PCR扩增

4.2.1.1确定最佳扩增模板量

琼脂糖凝胶电泳结果显示,oligo dT Primer 转录后进行第一轮扩增使用2μl作为模板扩增条带强清晰且无杂带,选择2μl为最佳扩增模板量;random 6-mers转录后进行第一轮扩增使用2μl作为模板扩增条带清晰且无杂带,选择2μl为最佳扩增模板量。

2 使用不同cDNA模板量的琼脂糖凝胶电泳

4.2.1.2第一轮PCR扩增和回收

引物

项目

Oligo dT Primer

单个反应模板量

2μl

反应个数

130

Random 6-mers

单个反应模板量

2μl

反应个数

130

合并后

回收后DNA体积

1080μl

回收后DNA浓度

55.5 ng/μl

回收后DNA总量

59.9ug

4.2.2第二轮PCR扩增

4.2.2.1确定最佳扩增模板量

琼脂糖凝胶电泳结果显示,第二轮扩增使用0.1μl作为模板扩增条带清晰且无杂带,选择0.1μl为最佳扩增模板量。

3 使用不同的第一轮PCR产物模板量的琼脂糖凝胶电泳

4.2.2.2第二轮PCR扩增和回收

项目

每个反应模板量

0.1μl

反应个数

576

合并后

回收后DNA体积

2760μl

回收后DNA浓度

241.4ng/μl

回收后DNA总量

666.3μg

4.3载体和PCR产物酶切、连接

4.3.1 酶切、连接检测结果

项目

载体酶切回收

使用载体量

10μg

回收后体积

50μl

回收后浓度

80.7ng/μl

回收后总量

4.0μg

PCR产物酶切回收

使用PCR产物量

4μg

回收后体积

50μl

回收后浓度

55.5ng/μl

回收后总量

2.8μg

连接产物回收

回收后DNA体积

50μl

回收后DNA浓度

114.1ng/μl

回收后DNA总量

5.7ug

4.4细菌文库构建

4.4.1细菌文库检测

项目

连接效率

1.2× 108pfu/100ng

库容量

2.3× 109pfu

阳性克隆率

96%

细菌库体积

50 ml

细菌库OD600

77.88

4.4.2阳性克隆率菌落PCR

菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果显示,挑选的55个单克隆有53个为阳性克隆,阳性率为96%,细菌文库阳性克隆率符合要求。

4菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果

4.4.3序列多样性

随机挑选48个单克隆测序后使用GENtle软件转录翻译成蛋白质序列,序列多样性比对显示48个序列均为独立序列,多样性100%,细菌文库多样性符合要求要求。

5序列多样性比对

4.5噬箘体文库制备

4.5.1噬菌体文库检测

项目

体积

1.0 ml

效价

4.8×1012 pfu/ml


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