实验流程

1.      抗原混合

1.1      将抗原从-80冰箱中拿出,常温溶解,避免反复冻融。做好标记

1.2 抽取抗原:根据抗原浓度抽取 800μg,添加无菌超纯水至体积 1000μl混匀,加入同体积弗氏佐剂1000μl,共 2ml混合进行乳化。


2.      羊驼免疫和采血

2.1 羊驼选择:选择健康强壮、精神状态良好、体型适中的羊驼,挑选的羊驼毛色光亮,无受伤不适症状。挑选好动物,先预养 1 周左右以淘汰有些不合格的动物,使后期的实验能顺利进行。

2.2 免疫:挑选好羊驼并确保动物适合,记录耳号后开始免疫实验。每次在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射,每侧分2点注射,每点注射1ml乳化抗原。免疫后观察30min确认羊驼状态良好,无不适症状,每2周免疫一次。

2.3 采血和血清分离:在每次免疫前进行采血用于免疫评价,采血从羊驼颈部静脉采取,每次取5ml血液,3000rpm 离心 10min,分离保存上层血清。



3.      分离外周血单个核细胞(PBMC

3.1  将离心机预温至 25,使用前关闭刹车;

3.2  50ml 离心管中分别加入 15ml PBS 15ml 新鲜血液进行稀释,翻转数次混匀;

3.3 15ml 分离液于新 50ml离心管中,向分离液管中加入稀释好的血液,小心缓慢以防止血液和分离液混匀;

3.4 500 g 离心 30min,观察离心管中血液分离情况,用 200μl移液器小心吸取出中间棉层免疫细胞至新的 15ml离心管中,上层血清保存在新的离心管中,-80保存;



3.5  向单核细胞液中加入3倍体积PBS缓冲液混匀,400g离心 15min

3.6  去除上清液,每管加入 3ml PBS缓冲液混匀并进行细胞计数,400g 离心20min

3.7 去除上清液,根据细胞数目使用 RNAiso Plus 溶解分离得到的淋巴细胞108/mL溶解液,-80保存。


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