实验流程



1.     抗原混合

1.1     将抗原从-80℃冰箱中拿出,常温溶解,避免反复冻融。做好标记。

1.2抽取抗原:根据抗原浓度抽取800μg,添加无菌超纯水至体积1000μl,混匀,加入同体积弗氏佐剂1000μl,共2ml混合进行乳化。

2.     羊驼免疫和采血

2.1羊驼选择:选择健康强壮、精神状态良好、体型适中的羊驼,挑选的羊驼毛色光亮,无受伤不适症状。挑选好动物,先预养1周左右以淘汰有些不合格的动物,使后期的实验能顺利进行。

2.2免疫:挑选好羊驼并确保动物适合,记录耳号后开始免疫实验。每次在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射,每侧分2点注射,每点注射1ml乳化抗原。免疫后观察30min确认羊驼状态良好,无不适症状,每2周免疫一次。

2.3采血和血清分离:在每次免疫前进行采血用于免疫评价,采血从羊驼颈部静脉采取,每次取5ml血液,3000rpm离心10min,分离保存上层血清。

3.     分离外周血单个核细胞(PBMC)

3.1 将离心机预温至25℃,使用前关闭刹车;

3.2 在50ml离心管中分别加入15mlPBS和15ml新鲜血液进行稀释,翻转数次混匀;

3.3加15ml分离液于新50ml离心管中,向分离液管中加入稀释好的血液,小心缓慢以防止血液和分离液混匀;

3.4500 g离心30min,观察离心管中血液分离情况,用200μl移液器小心吸取出中间棉层免疫细胞至新的15ml离心管中,上层血清保存在新的离心管中,-80℃保存;



3.5 向单核细胞液中加入3倍体积PBS缓冲液混匀,400g离心15min;

3.6 去除上清液,每管加入3mlPBS缓冲液混匀并进行细胞计数,400g离心20min;

3.7去除上清液,根据细胞数目使用RNAiso Plus溶解分离得到的淋巴细胞108/mL溶解液,-80℃保存。



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